راههای تشخیص بیماری توکسوپلاسموز

چکیده: کلیات بیماری توکسوپلاسموز و مروری بر پاتوژنز و روش های تشخیص بیماری

بخش دوم: پاتوژنز (بیماریزایی)

بخش سوم: راههای تشخیص بیماری توکسوپلاسموز

بخش چهارم: نتایج و روش کار بیماری توکسوپلاسموز


بررسی میزان آگاهی دانشجویان دختر دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز در مورد بیماری توکسوپلاسموز و مروری بر پاتوژنز و روش های تشخیص بیماری

توکسوپلاسموز یک بیماری انگلی است که عمدتاً توسط گربه ها منتقل مـی شـود. ایـن بیمـاری بوسیله خوردن گوشت خام یا از طریق تماس با مدفوع گربه، به انسان منتقل می شـود. ایـن بیمـاری مخصوصاً برای زنان باردار، که جنین آنها می تواند از طریق جفـت آلـوده شـود، و افـرادی بـا سیـستم ایمنی تضعیف شده، مثل افراد آلوده به HIV، خطرناک مـی باشـد. در مـوارد شـدید، توکـسوپلاسموز میتواند باعث آسیب به مغز، چشم ها و حتی مرگ شود. توکسوپلاسموز به وسیله روشهای سـرولوژی مثل الایزا، ایمونوفلورسنت غیر مستقیم، بافتشناسی، جداسازی انگـل و واکـنش زنجیـره ای پلیمـراز (PCR) تشخیص داده می شود. در روش PCR که روش نـسبتا جدیـدی اسـت از شناسـایی و تکثیـر  قطعه ای از ژنوم انگل برای تشخیص استفاده می شـود. بررسـی حاضـرجهت سـنجش میـزان آگـاهی دانــشجویان دختــر دانــشکده دامپزشــکی دانــشگاه شــیراز در مــورد جنبــه هــای گونــاگون بیمــاری توکسوپلاسموز با تکمیل پرسشنامه ای توسط ۱۰۰ نفر از دانـشجویان کارشناسـی و دکتـرای عمـومی  دامپزشکی انجام گرفت. نتایج نشان داد که آگاهی دانشجویان در مورد عامـل بیمـاری (۸۷%)، مخـزن بیماری ( ۹۱%)، راه انتقال از طریق مـادر بـه جنـین (۹/۸۶%)، انتقـال از طریـق مـصرف گوشـت خـام (۵/۸۲%) و عوارض بیماری مثل سقط جنین (۹/۸۷%) در سطح بالا می باشد. در این بررسی رابطـه ای بین میزان آگاهی دانـشجویان بـا سـطح تحـصیلات پـدر و مـادر مـشاهده نـشد. آگـاهی دانـشجویان کارشناسی در مواردی مثل انتقال بیماری از طریق مادر به جنین و تماس با خاک بهتر از دانـشجویان دکترا بود (۰۵/ ۰>P). در مورد بهترین راه مبارزه با بیماری که رعایت موازین بهداشتی می باشد دانش دانشجویان دکترا بالاتر از دانشجویان کارشناسی بود (۰۵/ ۰>P). به نظر می رسد بهترین راه جهت بالا میزان آگاهی افراد جامعه معرفی و شناساندن این بیماری در بین همـه اقـشار جامعـه از طریـق
مراکز بهداشتی- خدمات درمانی، رسانه های گروهی و مدارس باشد. هم چنـین لازم اسـت عـلاوه بـر میزان آگاهی، بینش و عملکرد دانشجویان و سایر اقشار جامعه در رابطه با اعمال پیشگیرانه و مـوازین بهداشتی مربوط به این بیماری نیز مورد بررسی قرار بگیرد.

مقدمه و هدف

در عصر حاضـر، بـالا رفـتن سـطح فرهنـگ بهداشـتی جوامـع، هـر چنـد توانـسته اسـت چهـره اپیدمیولوژیک بیماری ها را تغییر دهد، اما هنوز هـم بیماریهـای عفـونی بـه عنـوان مهمتـرین مـسأله  بهداشتی در بسیاری از کشورها محسوب می شوند؛ یکی از این بیماریها توکسوپلاسموز می باشد.  مطالعات نشان داده است که حدود یک سوم جمعیت بـالغ در بیـشتر کـشورهای جهـان شـواهد سـرولوژیک علیـه عفونـت توکـسوپلاسمایی را داشـته و دارای آنتـی بادیهـای ضـد توکـسوپلاسمایی میباشند. این موضوع بیانگر این است که این افراد قبلاً بـا توکـسوپلاسما آلـوده شـده انـد؛ همچنـین قدرت آلوده کنندگی و انتشار سریع این انگل را نشان میدهد.  توکسوپلاسموز یکی از بیماریهای مشترک بین انسان و دام می باشد که بر اثـر عفونـت بـا نـوعی انگل داخل سلولی به نام توکسوپلاسما گوندی بوجود می آید. عفونت با این انگل در انسان، پستانداران و پرندگان انتشار جهانی دارد. در دام نیز، بخصوص در گوسـفند یکـی از عوامـل عمـده سـقط جنـین محسوب می شود.گربه و گربه سانان نیز در چرخه زندگی انگل نقش میزبان نهایی را دارند.  انسان از دو طریق اکتسابی و مادر زادی به این انگل مبتلا می شود، سیر بیماری در بـدن انـسان شامل دو مرحله حاد و مزمن است که اکثر علائم و عوارض و همچنین انتقال انگل از مادر به جنین در مرحله حاد رخ می دهد.  در حالت مادرزادی انگل از جفت عبور میکند و بسته به اینکه در چه سنی از بارداری آلودگی بـه جنین منتقل شود علائم کلینیکی متفاوت است. ایـن علائـم بـه صـورت هیدروسـفالی، میکروسـفالی، کوریورتینیت، آنسفالومیلیت، مرده زایی، بزرگ شدن طحال و کبد، اختلالات ذهنی و حرکتی، تـشنج، لوچی و کوری نمایان می شود. به همین دلیل توکسوپلاسموز مادرزادی از نظر پزشکی اهمیت خاصی داشته و آگاهی خانم ها در مورد بیماری و راههای انتقال بیماری می تواند تا حد زیـادی از بـروز ایـن ٢ شکل از بیماری بکاهد؛ لذا این پژوهش، جهت سـنجش و بررسـی میـزان آگـاهی جمعـی از دختـران دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز در مورد این بیماری انجام شده است. هـم چنـین مـروری نیـز بـر پاتوژنز و روش های تشخیص این بیماری خواهیم داشت.

راههای تشخیص توکسوپلاسموز

توکسوپلاسموز در اکثر بیماران علائمی ایجاد نمیکند و در صورت بروز علائم، نشانه های بـالینی غ یر اختصاصی بوده و تشخیص قطعی بدان وسیله امکان پذیر نیست.
توکسوپلاسموزیس بوسیله جداسازی ارگانیسم، تست های سرولوژیکی، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و نشان دادن تاکیزوآیتها در بافتها و مایعات بدن بوسیله روش های بافت شناسی تـشخیص داده می شود.

جداسازی ارگانیسم

کشت توکسوپلاسما روش خاصی است کـه دلیـل روشـنی از عفونـت مـی دهـد. جـدا کـردن یـا شناسایی انگل در تشخیص عفونت جنینی و عفونت در افراد با نقص سیستم ایمنی مفیـد مـی باشـد. جداسازی معمولا به وسیله تلقیح مواد مـشکوک شـامل خـون، مایعـات و ترشـحات آلـوده بـدن و یـا نمونههای بافتی به حیوانات آزمایشگاهی، کشت سلول و تخم مرغ جنین دار انجام می شود. جدا شدن انگل از مایعات بدن حاکی از عفونت حاد است، در صورتی که جداسازی از بافت وجود کیست بافتی را اثبات میکند و الزاماً به معنی عفونت فعال نمی باشد. نمونه ها بعد از جمع آوری هر چه سریعتر باید به حیوانات و کشت سلول تزریق شوند تا از مـرگ انگل جلوگیری شود. نمونه ها قبل از تلقیح باید آماده سازی شوند. افزودن فرمالین و انجماد نمونه هـا موجب مرگ انگل می شود. برای نگهداری کوتاه مدت نمونه ها، یخچال ۴ درجه سـانتی گـراد تـرجیح داده می شود.

تلقیح به حیوان آزمایشگاهی
بدون شک بهترین حیوان آزمایشگاهی که دارای حساسیت فوق العاده ای نسبت به توکسوپلاسما می باشد، موشهای سفید کوچک آزمایشگاهی (سوری) می باشد. علاوه بر حساسیت آنهـا بـه عفونـت، آلودگی طبیعی به ندرت در آنها دیده می شود. هامـستر هـا هـم وضـع مـشابهی دارنـد. رت هـا بـه توکسوپلاسما مقاوم بوده و خوکچه هندی و خرگوش دارای آلودگی طبیعی هستند. نمونه به طور داخـل صـفاقی یـا از راه مغـزی بـه موشـی کـه از نظـر وجـود آنتـی بـادی علیـه توکسوپلاسما منفی باشد، تلقیح می شود. حجم مواد تلقیحی از راه مغزی نبایـد بـیش از ٠٢/ ٠ میلـی لیتر باشد زیرا ممکن است حیوان را بکشد. در تزریق به داخل صـفاق میلـی لیتـر از سوسپانـسیون آماده شده از نمونه تزریق می شود. به هنگام تلقیح، تعدادی موش سالم به عنوان شاهد در نظر گرفته میشود.
در مواردی که سویهی ارگانیسم های تلقیح شده برای موش بیمـاری زا باشـند، توکـسوپلاسما را میتوان بعد از ١٠-۵ روز در مایع صفاقی بوسیله گسترش های رنگ آمیزی شده با گیمـسا، رایـت و یا بدون رنگ آمیزی نشان داد. انگل در نمونه های مستقیم بدون رنگ آمیزی به رنـگ سـبز کمرنـگ دیده می شود.

اگر سویه ای برای موش بیماری زا نباشد، برای نشان دادن انگل یک دوره ۶-۴ هفتـه لازم اسـت. اگر بعد از ۶ هفته موش زنده ماند، از سـیاهرگ دمـی آن بـرای انجـام تـست سـرولوژیک، خـونگیری میشود. چنانچه سرم حاوی پادتن باشد، مغز حیوان به منظور یافتن کیست بافتی توکسوپلاسما مـورد جستجوی میکروسکوپی قرار میگیرد. برای این کار اسمیر های تهیه شده، با رنگ هایی مثل گیمسا، متیلن بلو١، کریستال ویوله و نوترال رد رنگ آمیزی می شود. در مواردی که سرم موش از نظر وجود پادتن مثبت است و یستی دیده نشد، تزریق داخل صفاقی بافت مغز به موش دیگر بایـد انجـام شـود. تلقیح حیوانی خیلی حساس تر از کشت سلولی است. عیب این روش این است که وقت گیر بـوده و معمولاً ۶-۴ هفته طول میکشد.

کشت سلول
توکسوپلاسما می تواند در انواع کشت های سلولی تک لایه مثل Vero، MRC5، Hep2، سـلولهـای L و سلولهای هِلا تکثیر شود.

در سال ١٩٨۵ روشی را برای کشت توکسوپلاسما تشریح شد که این روش در مـورد نمونـه هـای خون، مایع نخاع، ترشحات جفت و احتمالاً سایر بافت ها کاربرد دارد.

بعد از تلقیح نمونه سلول ها برای ۴ روز گرمخانهگذاری مـی شـوند، سـپس بـا آنتـی بـادی ضـد توکسوپلاسمای خرگوش مخلوط و با آنتی گلوبولین علیه IgG خرگوش حاوی فلورسنت، با استفاده از روش ایمونوفلورسنت مستقیم تعیین می شود و حضور انگل با میکروسـکوپ فلورسـنت خوانـده مـیشود. مزیت کشت سلول این است که نسبت به روش تلقیح به موش، سریعتر انجام می شـود.

جنین مرغ از هر طریقی می تواند آلوده شود، اما متداولترین روش مورد استفاده، از طریـق پـرده کوریوآلانتوئیک است. تاکیزوآیتها ضایعاتی مشابه ویروس های آبله  در پرده کوریوآلانتوئیک تولیـد میکنند. از این روش می توان به عنوان منبع توکسوپلاسما برای تست رنگی و سـایر روش هـای تشخ یصی استفاده کرد.
تحقیقات انجام گرفته روی تاکیزوآیتهای مـشتق شـده از کـشت سـلول، نـشان مـی دهـد کـه میتوانند به طور موفقیت آمیزی به عنوان منبع ارگانیسم زنده در تست رنگی و سایر تست هـایی کـه نیاز به انگل زنده دارند، استفاده شود. این تکنیک نسبت به تلقیح به حیوان زنده، سریع تر، ساده تـر و ارزان تر بوده و این امکان را برای بیمارستان های عمومی فراهم مـیکنـد تـا بتواننـد تـست رنگـی را سریعتر و با ویژگی بالاتر انجام دهند. به دلیل اینکه جداسازی ارگانیسم با استفاده از دو روش فوق نیاز به ارگانیسم زنده داشته، واکنش زنجیره ای پلیمراز به دلیل حساسیت بیشتر به طور فزاینده ای جایگزین روشهای کشت امروزی شـده است و قادر به شناسایی انگل های غیر زنده در نمونه های مورد مطالعه می باشد.

تشخیص بافت شناسی
یافتن تروفوزوئیت ها در مقاطع بـافتی و یـا گـسترش تهیـه شـده از نمونـه بـرداری مغـز، مغـز استخوان، مایع مغزی نخاعی و مایع آمنیوتیک زنان حامله نشانه عفونت حاد توکـسوپلاسموز اسـت. مشخص نمودن تاکیزوآیتها به وسیله روشهای متداول رنگ آمیزی مشکل اسـت، امـا بـا اسـتفاده از روش های ایمنوفلورسنت آنتی بـادی و رنـگ آمیـزی بـا پراکـسیداز آنتـی پراکـسیداز (PAP) بـرای تشخ یص توکسوپلاسموز با موفقیت همراه است و حساس بودن و اختصاصی بـودن ایـن روش هـا نسبت به روشهای متداول رنگ آمیزی اثبات شده است.
تکنیک ایمنوپراکسیداز یا PAP به طور موفقیـت آمیـزی بـرای یـافتن انگـل در سیـستم عـصبی مرکزی بیماران مبتلا به ایدز استفاده شده است. این تکنیک قابل استفاده برای مقاطع بـافتی فـیکس نشده و مقاطع بافتی فـیکس شـده و جاسـازی شـده در پـارافین مـی باشـد. مزیـت تکنیـک ایمنوپراکسیداز به روش ایمنوفلورسنت آنتی بادی این است کـه بـا میکروسـکوپ معمـولی مـی تـوان واکنش را بررسی کرد.

تست های سرولوژیکی

تست های سرولوژی یکی از روش های معمول تشخیص در افراد با سیستم ایمنی کامل میباشند که در بیشتر آزمایشگاه ها کاربرد دارند. این تست ها معمولا بـه صـورت کیـت هـای تجـاری مختلـف جهت جهت سنجش آنتی بادی بر علیه توکسوپلاسما، در بازار موجود می باشـند. در ایـن مبحـث بـه مهمترین آنها اشاره خواهد شد.

تست رنگی یا استاندارد طلایی
این تست بـرای اولـین بـار توسـط سـابین و فلـدمان در سـال ۱۹۴۸ مـیلادی بـرای شناسـایی آنتیبادیهای اختصاصی نوع IgG علیه توکسوپلاسما گوندی شرح داده شد . در این تست از انگـل زنده که از تلقیح به حیوان آزمایشگاهی به دست آمـده اسـت، اسـتفاده مـی شـود. ایـن تـست دارای حساس یت بالا و کاملاً اختصاصی است. هر چند از این تست در بیشتر آزمایشگاه ها استفاده نمی شود، ولی به عنوان یک آزمایش قطعی برای تشخیص توکسوپلاسموزیس انسان در آزمایشگاه هـای مرجـع کاربرد دارد.
اساس این تست از نوع خنثی کننده با واسطه کمپلمان در واکنش آنتی ژن- آنتـی بـادی اسـت. در این آزمایش تاکیزوآیتهای زنده با فاکتور فرعی (کمپلمان سرم انسان) و سرم مـورد آزمـایش بـه مدت یک ساعت در گرمخانه ۳۷ درجه سانتیگراد قـرار مـیگیـرد و رنـگ متـیلن بلـو بـه آن افـزوده میشود. در صورتی که تاکیزوآیتها تحت تأثیر آنتی بادی قرار نگیرند به طور یکنواخت با متیلن بلـو رنگ میگیرند، اما در حضور آنتی بادی و کمپلمان، تاکیزوآیتها لیز شـده و مـواد سیتوپلاسـمی بـه بیرون ریخته می شود در نتیجه با متیلن بلو ترکیب نشده و بی رنگ بـه نظـر مـی رسـد. تیتـری کـه گزارش میشود رقتی است که در آن ۵۰% از تاکیزوآیتها رنگ نشده بـاقی بمانـد. مـوارد مثبـت تست رنگی نشان دهنده این است که بیمار به انگل آلوده شده است. موارد منفی هم اکتـساب عفونـت را چه در زمان حال و چه در زمان قبل رد میکند، مگر اینکه بیمار دچـار هایپوگامـاگلوبینمی باشـد.
IgG معمولاً ۱ تا ۲ هفته بعد از کسب عفونت ظـاهر مـی شـود، در ۸-۶ هفتـه بـه حـداکثر خـود میرسد پس از آن به تدریج کاهش می یابد. تیتر های پایین برای مدت های طولانی (گـاهی تـا آخـر عمر) در بدن باقی می مانند. در تعداد کمی از بیماران آنتی بادی های IgG ممکن است در طی ۲ تا ۳ هفته بعد از اولین مواجهه با انگل قابل شناسایی نباشد.

 

آزمایش ایمونوفلورسنت غیر مستقیم (IFT)
آزمایش غیر مستقیم ایمونوفلورسنت را می توان برای تعیین و اندازه گیری پـادتن در سـرم و یـا مشخص ساختن آنتی ژن در بافت یا کشت سلول به کار برد. این تست هماننـد تـست رنگـی نیـاز بـه انگل زنده دارد و برای سنجش مقدار IgG به کار می رود..

در این روش ابتدا مرحله تاکیزوآیت سویه RH،که ۴-۳ روز پس ازتلقیح داخل صفاقی به موش به دست می آید با استون روی لام فیکس می شود (امروزه این لام ها به صورت کیـت هـای تجـاری در دسترس می باشد و قابل استفاده در همه بیمارستان هـا مـی باشـد). آنتـی ژن روی اسـلاید در معرض رقت های مختلف سرم بیمار که مشکوک به داشتن آنتـی بـادی هـای اختـصاصی اسـت قـرار میگیرد. برای اینکار به مدت نیم ساعت در ۳۷ درجه سانتی گراد و محفظه مرطوب، گرمخانـهگـذاری می شوند. آنتی بادی های موجود در سرم به آنتی ژن های انگل متصل می شوند و در ادامـه آن بـرای حذف آنتی بادی های اضافه و باند نشده یک مرحله شستشو انجام میگیرد. سپس آنتیگلوبولین های نشاندار با ماده فلورسنت به این مجموعـه افـزوده و دوبـاره گرمخانـهگـذاری مـی شـود. بعـد از زمـان انکوباسیون، یک مرحله شستشو برای شستن آنتیگلوبولین های اضافه و باند نـشده انجـام مـیگیـرد.

سپس مجموعه زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می شود. وجود خاصیت فلورسنت که در زیـر نـور ماوراء بنفش مشخص می شود نشان دهنده وجود آنتی بادی در سرم خواهد بود. بیشتر از فلورسن ایزوتیوسیانات (FITC)٢ به عنوان ماده فلورسنت استفاده مـی شـود کـه در زیـر میکروسکوپ فلورسنت رنگ سبز درخشان از خود ساطع میکند. نیاز به میکروسکوپ فلورسنت،ترکیبات اختصاصی گونـه ای، واکـنش متقـاطع فـاکتور روماتوئیـد (RF) و آنتی بادی های ضد هسته۴ جزء معایب این تست محسوب می شود.

روش اصلاح شده ایمونوفلورسنت غیر مستقیم (IFA-IgM) برای شناسایی آنتی بادی های IgM در کودکان مبتلا به عفونت مادرزادی توسـعه یافتـه اسـت. IgM در ۷۵% عفونـت هـای مـادرزادی و ۹۷%  عفونت های بالغین دیده شده است. این تست روش انتخابی نبوده و می تواند سبب بروز نتـایج مثبـت کاذب IFA -IgM گردد.

 

روش لاتکس آگلوتیناسیون (LA)
در این آزمایش ذرات لاتکس توسط آنتی ژن های خالص شـده از ارگانیـسم هـای توکـسوپلاسما پوشانده می شوند. برای این کار ابتدا کربودیماید به ذرات لاتکس اضافه شده و به آن متصل می شود. در مرحله بعد آنتی ژن افزوده می شود که این آنتی ژن ها به کربودیمایـد متـصل مـی شـوند. الگـوی آگلوتیناسیون پس از افزودن سرم مشاهده می شود.
این تست ساده و ارزان بوده و نیاز به رنگ آمیـزی و تجهیـزات خاصـی نـدارد بـه سـرعت انجـام میشود. حساسیت آن کمتر از تست رنگی و تست ایمونوفلورسنت غیرمستقیم می باشد  و بیـشتر برای غربالگری سرم های انسانی مناسب شناخته شده است.

روش آگلوتیناسیون افتراقی
این تست با نام تست HS/AC هم شناخته می شود. این تست جهت تمایز التهاب حـاد از التهـاب مزمن مفید می باشد و بهتر است با دیگر تست های تشخیصی مورد استفاده قرار گیرد.  در این تست از دو آنتی ژن AC و HS استفاده می شود. به دنبال عفونت حاد، آنتـی بـادی هـایی علیه آنتی ژن AC تولید می شود و در مراحل بعدی عفونت، آنتـی بـادی هـایی بـر ضـد آنتـی ژن HS ساخته می شود. نسبت تیتر استفاده شده AC در مقابل HS بـه عنـوان نمونـه هـای حـاد، مـشکوک، نمونههای غیر حاد فعال و یا غیر فعال تفسیر می شود.

 

روش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (IHA)
در این روش آنتی ژن محلول تاکیزوآیتها بر روی گلبول قرمز خـون قـرار مـیگیـرد و بوسـیله سرمی که حاوی آنتی بادی های اختصاصی علیه تاکیزوآیتهاست، آگلوتینه مـی شـود. بـا تهیـه رقت های سرمی می توان به صورت نیمه کمی از این تست استفاده کرد.  هماگلوتیناسیون غیر مستقیم قادر به کشف IgG مشابه تست رنگی است، ولی تأخیری چنـد روزه دارد. روش اصلاح شده این تست با استفاده از گلبول های قرمز مرغ و برخی آنتی ژن هـای تهیـه شده از غشاء تاکیزوآیتها جهت اهداف غربالگری و مطالعات جمعیتی مفید است. حـساسیت این تست نسبت به تست رنگی و ایمونوفلورسنت غیر مستقیم کمتر می باشد.

 

تست جذب ایمنی با واسطه آنزیم یا الایزا (ELISA)٢
در واقع الایزا یکی از انواع تغییر یافته سنجش ایمنی آنزیمی (EIA) است که گاه با همـین اسـم (EIA) نیز خوانده می شود. این تست به علت حساسیت بالا و همچنین سهولت تفسیر برای تـشخیص بسیاری از بیماری های انگلی استفاده می شود.
الایزا به چند گروه تقسیم می شود که در تـشخیص توکـسوپلاسموزیس بیـشتر از روش الایـزای غیرمستقیم و الایزای دولایه یا ساندویچ استفاده می شود. در آزمایش الایزا از پلیت های میکروتیتر با جنس پلی استیرن که دارای حفره های متعددی است استفاده می شود.

  •  الایزای غیر مستقیم

این تست برای تعیین آنتی بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی بادی در نمونه های سرمی مورد استفاده قرار میگیرد. آنتی ژن محلول انگل بر سطح داخلی حفره های میکروتیتر پوشانده مـی شـود.

بعد از یک مرحله شستشو برای حذف آنتی ژن های اضافی، سرم بیمار به این حفره ها افـزوده شـده و گرمخانهگذاری می شود تا در صورت وجود آنتی بادی، کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی تـشکیل شـود. وباره مرحله شستشو انجام می شود و آنتیگلوبولین انسانی که توسط آنزیم نـشاندار شـده بـه حفـره افزوده می شود. بر حسب اینکه چه کلاسی از آنتی بادی اهمیت دارد، نوع آنتیگلوبـولین انـسانی کـه مورد استفاده قرار میگیرد متفاوت است. پس از مدت لازم برای تأثیر، دوباره شستشو انجام می شـود. وجود آنزیم در مجموعه را بوسیله سوبسترای آن می توان نشان داد، محلول سوبسترا حاوی ماده رنگزا است که در صورت واکنش آنزیم و سوبسترا رنگ تولیـد مـی شـود. شـدت رنـگ متناسـب بـا مقـدار آنتیگلوبولینی است که به آنتی بادی متصل شده و بیانگر میزان آنتی بادی در سرم است. شدت رنـگ توسط دستگاه الایزا ریدر١ خوانده می شود. نوع آنزیم بیشتر پراکسیداز ترب کـوهی(HRP) اسـت کـه پراکسید هیدروژن به عنوان سوبسترای آن می باشد.

  • الایزای ساندویچ 

خود این آزمون با دو روش مجزا انجام می شود: ساندویچ دو لایه آنتی بادی یا کاپچر آنتـی ژن و ساندویچ آنتی ژن یا کاپچر آنتی بادی مستقیم۵.

  •  الایزا به روش کاپچر آنتی بادی

یک روش دیگری است که برای تعیین سنجش آنتی بادی مورد استفاده قـرا مـیگیـرد؛ بـه ایـنصورت که از یک آنتی ژن پوشانده شده در داخل حفره های پلیت میکروتیتر، بـرای بـه دام انـداختنآنتی بادی اختصاصی آن استفاده می شود و همان آنتی بادی از طرف بازوی دیگر(Fab) پذیرای همان آنتی ژن، اما به صورت نشاندار می باشد، در نتیجه آنتی بادی اختصاصی در بین دو آنتی ژن سـاندویچ میگردد. این روش یکی از حساس ترین روش ها برای تشخیص آنتی بادی در نمونه است.

  • الایزا به روش کاپچر آنتی ژن

در این روش یک آنتی ژن بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار میگیرد؛ به این صـورت کـه از یـک آنتی بادی که در داخل حفره پوشـانده شـده، بـرای بـه دام انـداختن آنتـی ژن اسـتفاده مـی شـود و آنتیبادی دوم که با آنزیم نشاندار شده اسـت، بـه عنـوان شناسـاگر عمـل مـیکنـد. از ایـن روش میتوان برای شناسایی آنتی ژن ها در خون در دوره حاد توکسوپلاسموز استفاده کرد. همچنـین الایزا به روش ساندویچ، قادر به شناسایی آنتی ژن ها و آنتی بادی های موجود در ادرار زنان آبـستن و بیماران چشمی مبتلا به توکسوپلاسموزیس می باشد.

تست سنجش آگلوتیناسیون جذب ایمنی ایمونوگلوبولین M (ISAGA-IgM)
این آزمایش تلفیقی از آگلوتیناسیون و الایزا اسـت کـه در آن آنـزیم حـذف شـده اسـت. در ایـن آزمایش حفرات صفحات میکروتیتر با آنتیگلوبولین های IgM انسانی پوشیده مـی شـود؛ بعـد از یـک ها مرحله شستشو، سرم ی مورد آزمایش به حفره ها افزوده می شود و جهت امکـان اتـصال، بـه مـدت یک شب در گرمخانه ۳۷ درجه سانتیگراد قرار میگیرد؛ دوباره شستشو انجـام شـده و سوسپانـسیون تاکیزوآیتها به حفره ها افزوده می شود؛ نتیجه آزمایش همانند روش آگلوتیناسیون قابل رؤیت است؛ در صورت وجود IgM اختصاصی در سرم بیمار، واکنش صورت گرفتـه و آنتـی ژن تثبیـت شـده انگـل آگلوتینه می شود. چنانچه سرم بیمار فاقد IgM باشد توکسوپلاسما گوندی در ته حفره رسوب کـرده و واکنش منفی به دست می آید. این آزمایش سریعتر و آسانتر از ELISA-IgM است با این وجود آزمایش ISAGA-IgM به مقادیر بیشتری تاکیزوآیت نیاز دارد.

تست اویدیتی
این تست برای تمایز بین عفونت گذشته و عفونت اکتسابی اخیر توسعه یافته اسـت. اویـدیتی بـر مبنای میل ترکیبی بین آنتی بادی و آنتی ژن تعریف میگردد. میل ترکیبی آنتی بـادی و آنتـی ژن را افینیتی، و افینیتی عملکردی را اویـدیتی مـی نامنـد. IgG ایجـاد شـده در نخـستین مواجهـه آنتیژن با سیستم ایمنی دارای افینیتی پایین می باشد و با گذشت زمان بعد از هفته ها یا ماه هـا بـه طور فزاینده ای افزایش می یابد و IgG با اویدیتی بالا ایجاد می شود.  در تست اویدیتی IgG به روش الایزا، از اوره یا یک عامل دیگر که مـی توانـد پـروتئین را دنـاتوره کند برای جدا کردن کمپلکس آنتی بادی-آنتی ژن استفاده مـی شـود در صـورت پـایین بـودن میـل  ترکیبی آنتی بادی به آنتی ژن عوامل دناتوره کننده مانع تشکیل کمپلکس ایمنی مـی شـوند و یـا در صورت سست بودن اتصال آنتی بادی به آنتی ژن، از طریق تخریب پیوند هیدروژنی به صورت برگـشت پذیر، باعث از هم گسستن آن می شوند.
نتایج اویدیتی به صورت درصد بیان می شود و جدایی کمپلکس آنتی ژن- آنتی بـادی را بوسـیله عوامل دناتوره کننده منعکس میکند. تست ممکن است با یک رقـت از سـرم انجـام شـود، امـا نتـایج صحیح به وسیله تیتراسیون به دست می آید. بسته به روش استفاده، تست هـای اویـدیتی موجـود در  بازار به طور اولیه برای تعیین کردن این که عفونت در ۶-۴ ماه گذشته کسب نشده، مفید هستند. این امر اهمیت قابل توجهی در زنان آبستن دارد، به دلیل این کـه تعیـین زمـان عفونـت بـرای نگهـداری
آبستنی مهم و حیاتی می باشد.
این تست را نمی توان در همان اوایل عفونت استفاده کرد چرا که سطح آنتی بادی های IgG بایـد به اندازه کافی باشد تا عوامل دناتوره کننده بتوانند بر آن تأثیر داشته باشند. نشان دادن اویدیتی پایین آنتی بادی های IgG الزاماً به این معنی نیست که بیمار عفونت را اخیراً کـسب کـرده اسـت، بـه دلیـل اینکه اویدیتی پایین ممکن است در تعدادی از بیماران بیش از ۱ سال باقی بماند. اویدیتی بالا، تعیـین میکند که عفونت قبل از آبستنی کسب شده و هیچ خطری برای جنین ندارد، مگر اینکه بیمـار دچـار
نقص ایمنی باشد.

تفسیر نتایج سرولوژی
شناسا یی آنتی بادی های اختصاصی روش اولیه تشخیص بـرای تعیـین عفونـت بـا توکـسوپلاسما است. تست های سنجش آنزیمی و ایمونوفلورسنت غیر مستقیم برای تشخیص توسط مرکـز کنتـرل و پیشگیری از بیماری ها پیشنهاد شده و به صورت کیت های تجاری شامل آنتی بادی های اختـصاصی IgG و IgM در بسیاری از شرکت ها قابل دسترسی هستند.  در ابتدا برای تعیین وضعیت ایمنی فرد، باید حضور آنتی بادی های اختصاصی IgG تـست شـوند.  تیتر مثبت IgG نشان می دهد که آلودگی با ارگانیسم در زمانی اتفاق افتاده است. اگـر دانـستن زمـان دقیق عفونت لازم باشد یک فـرد IgG مثبـت بایـد یـک تـست IgM بوسـیله روش هـایی بـا کمتـرین واکنشهای غیر اختصاصی مثل، ELISA capture-IgM انجام دهد. یک تست منفـی IgM اساسـاً عفونـت اخیر را رد میکند. اما تفسیر یک تست مثبت IgM مشکل است، زیرا آنتی بادی هـای اختـصاصی IgM ممکن است به مدت ۱۸ ماه بعد از کسب عفونت حاد توسـط ELISA شناسـایی شـوند. مـشکل عمـده برای تست کردن IgM توکسوپلاسما، اختصاصی نبودن تست ها است. دو حالت غالباً اتفـاق مـی افتـد:

۱- افرادی با یک IgM مثبت و IgG منفی

۲- افرادی با نتایج مثبت IgG و IgM

در حالت اول یک نتیجه مثبت IgM با یک نتیجه منفـی IgG در نمونـه ای یکـسان بایـد بـا ظـن بیشتری بررسی شود. خون بیمار ۲ هفته بعد از اولین نمونه گرفته می شود و دو نمونه همزمان تـست  می شوند. اگر نمونه اولی در اوایل عفونت بیمار گرفته شده باشـد، بیمـار آنتـیبـادی هـای IgG و IgM مثبت بالایی را باید در نمونه دومی داشته باشد. اگر در هر دو نمونه IgG منفی و و IgM مثبت بود، نتایج IgM باید به عنوان مثبت کاذب تلقی شود و بیمار به عنوان غیر آلوده محسوب می شود.

در حالت دوم، نمونه دوم باید گرفته شود و هر دوی نمونه ها بـا هـم بـه یـک آزمایـشگاه مرجـع ارسال می شود که روش های مختلفی را برای تست کردن IgM برای تأیید به کـار مـی برنـد. قبـل از شروع اقدامات درمانی برای بیمار به علت توکسوپلاسموز حاد، همه IgG و IgM مثبـت هـا بایـد بـرای تست اویدیتی به آزمایشگاه مرجع فرستاده شوند.

اگر بیمار آبستن باشد و تیتر های IgG و IgM مثبت باشند، یک تـست اویـدیتی IgG بایـد انجـام شود. نتیجه اویدیتی بالا در ۱۶-۱۲ هفته اول آبستنی (زمان بـستگی بـه کیـت تجـاری دارد) عفونـت اکتسابی در طول آبستنی را به طور کامل رد میکند. نتیجه اویدیتی پایین IgG، نباید به عنوان نـشان دهنده یک عفونت اخیر تعبیر شود، زیرا بعضی افراد اویدیتی پایین IgG را برای مدت ها بعد از عفونت دارند. عفونت مشکوک اخیر، قبل از هر گونه مداخله، باید بوسیله نمونه های تست شده در آزمایـشگاه
تأیید مرجع شود. اگر بیمار علائم کلینیکی سازگار با توکسوپلاسموز داشته، اما تیتر IgG پـایین اسـت، با فرض اینکه بیمار به شدت دچار نقص ایمنی نیست، اگر بیماری به دلیل توکسوپلاسموز حاد باشـد، تیتر ۳-۲ هفته بعد باید یک افزایش را نشان دهد.
نوزادان مشکوک بـه توکـسوپلاسموز مـادرزادی، بایـد توسـط هـر دو روش ELISA capture-IgM و ELISA capture-IgA تست شوند. شناسایی آنتی بادی های اختصاصی IgA توکسوپلاسما در بچه هـایی که به طور مادرزادی آلوده شده اند، خیلی حساس تر از شناسایی IgM می باشد.

 

واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)
یکی از مهمترین پیشرفت ها در دو دهه اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی به ویژه در کاربرد هـای تشخیصی، واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد که به علت دارا بودن ویژگی و حساسیت بالا و سرعت و سهولت آن جایگاه ویژه ای در تحقیقات و تشخیص های مولکولی پیدا کرده است.

به طور کلی PCR به روش ازدیادِ جزئی از DNA یا RNA تا حد مـشاهده آنهـا توسـط روش هـای ساده رایج آزمایشگاهی اطلاق می شود. روش PCR بر مبنای سه روش ساده می باشد کـه انجـام ایـن سه مرحله در هر واکنش سنتز DNA ضرورت دارد و با دادن برنامه به ترمال سایکلر اجرا می شود.
مرحله دناتوره شدن یا تغییر ماهیت: در این مرحله مولکول هـای دو رشـته ای DNA بـه وسـیله حرارت بالا (حدود ۹۴ درجه سانتی گراد) از همدیگر جدا گردیده و به مولکـول هـای تـک رشـته ای تبدیل می شوند.
مرحله اَنلینگ یا پیوند زنی: در این مرحله کاهش دمای واکنش صورت میگیرد، تا اینکه پرایمر ها بتوانند به مولکول های DNA تک رشته ای پیوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده بـرای ایـن مرحله می تواند از ۳۰ درجه تا ۷۲ درجه سانتی گراد متغیر باشد.
مرحله توسعه یا اکستنشن٣: در این مرحله آنزیمِ تَـگ پلـی مـراز۴، پرایمـر هـا۵ را در روی DNA تکرشته ای ادامه می دهد تا DNA دو رشته ای جدید ساخته شـود. درجـه حـرارت لازم بـرای ایـن مرحله ۷۲ درجه سانتی گراد می باشد.
نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق، سنتز دو مولکول جدید DNA است. سنتز آنقدر ادامه مـی یابـد تا اینکه یکی از مواد تشکیل دهنده واکنش کاهش یابد و غیر فعال شود. به طور کلی ۳۵-۲۵ سـیکل کافی است تا از یک مقدار بسیار کم DNA، صد ها هزار نسخه DNA سنتز شود.

از جمله روش هایی که می توان DNA تکثیر شده را مشاهده کرد، الکتروفورز افقی با اسـتفاده از ژل آگاروز می باشد. ماده اتیدیوم برماید به این ژل افزوده شده و در نهایت محصول الکتروفـورز زیـر نور ماوراء بنفش برای دیدن باند های فلورسنت بررسی می شود. اتیدیوم های متـصل شـده بـه DNA نور بنفش از خود ساطع میکنند.

مواد یک PCR ساده شامل: بافر PCR، DNTP ١،MgCl2 آنزیم تگ پلی مراز، دو نـوع پرایمـر، روغـن معدنی و DNA الگو می باشد. PCR قادر به شناسایی DNA در انواع نمونه های جامد بافتی (بیوپسی٣ و اتوپسی۴) و مایعات بدن و خون می باشد.  واکـنش زنجیـره ای پلـی مـراز بـرای شناسـایی DNA توکـسوپلاسما در مایعـات بـدن بـه طـور موفقیتآمیزی برای تشخیص توکـسوپلاسموز مـادرزادی، چـشمی، مغـزی و توکـسوپلاسموز منتـشر استفاده شده است. روش PCR در توکسوپلاسما به وسـیله بـورگ و همکـارانش در سـال ۱۹۸۹ میلادی با تکثیر ۳۵ سیکل از سکانس ژنی ژن B1 به عنوان الگو توسعه پیدا کرد. تکنیـک هـای مختلف PCR برای تشخیص توکسوپلاسموز بـا اسـتفاده از تنـوع نمونـه هـای کلینیکـی شـامل مـایع آمنیوتیک، خون، مایع مغزی نخاعی، بافت بیوپسی، ادرار و دیگر مایعات بدن توسعه یافته است. بزرگترین مزیت تکنیک PCR این است که قادر است ژن B1 را از DNA خالص  شده نمونه هایی با تعداد کمتر از ۱۰ انگل در ۰۰۰, ۱۰۰ لوکوسیت انسان شناسایی کند از ژن های توکسوپلاسما، بیشتر ژن B1، ژن P30 و قطعه ۱۸s مربوط به DNA ریبوزومی (rDNA) به عنوان الگو انتخاب می شود. با این حال بیشتر از همه، ژن B1 با تنوع پروتکل هـای PCR و پرایمـر های متنوع منتشر شده است. حساسیت نتایج PCR می تواند به وسیله روش هـای اختـصاصی گـرفتن نمونـه، حمـل و نقـل و شرایط نگهداری نمونه، دقت تکنیک های استفاده شده برای شناسایی محصولات PCR و همچنین بـه وسیله استفاده قبلی از دارو های ضد توکسوپلاسما تحت تأثیر قرار گیرد.
واکنش زنجیره ای پلی مراز تشخیص توکسوپلاسموز مادرزادی را قبل از تولد بـه وسـیله توانـایی تشخیص سریع متحول کرده اسـت. بـه ایـن وسـیله از بیـشتر روش هـای تهـاجمی بـر روی جنـین جلوگیری می شود. خون محیطی، مایع مغزی نخاعی و ادرار برای آزمایشات PCR در نوزادان مشکوک به داشتن توکسوپلاسموز مادر زادی مورد رسیدگی قرار میگیرد.  واکنش زنجیره ای پلی مراز مایع زجاجیه و زلالیه در بیماران بـا ضـایعات غیـر تیپیـک شـبکیه، آنهایی که یک پاسخ غیر طبیعی به درمان اختصاصی توکسوپلاسما می دهند و یـا افـرادی کـه دچـار نقص سیستم ایمنی هستند می تواند مفید باشد. در بیماران نقص ایمنی مشکوک به توکـسوپلاسموز موضعی یا منتشر، PCR خون (بافی کوت)، مایعات آلـوده بـدن (شـامل لاواژ برونکـو آلوئـولار، مـایع مغزی نخاعی، صفاقی، جنبی، مایع آسیت و مایعات چشمی) و آسپیره کردن مغز استخوان یـا بافتهـا به عنوان کمک های تشخیصی مهم در نظر گرفته می شوند. یک نتیجه مثبت PCR بافت مغز ممکـن است یک بیمار با آنسفالیت توکسوپلاسمایی و یک شخصی با پاتولوژی متفاوت مغز که به طور مـزمن با توکسوپلاسما آلوده شده را از هم متمایز نکند.

روش های فیزیکی
اولترا سونوگرافی یک از این روش ها است که در زنـان آبـستن بـرای تـشخیص توکـسوپلاسموز مادرزادی در جنین کاربرد دارد. ام آر آی (MRI) و سـیتی اسـکن (Scan CT) نیـز از روشـهای مـورد استفاده برای توکسوپلاسموز در افراد با نقص سیتم ایمنی می باشد. اِسلیت لامپ هم برای مطالعـات چشمی در بیماران با توکسوپلاسموز چشمی مورد استفاده میگیرد.

 

ارسال دیدگاه

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *